La méthode PCR-RFLP - Polymorphisme de longueur des fragments de restriction

Extraits

[...] Cette étape a assuré la fluorescence de l'ADN lorsque le gel a été observé sous une lampe UV. Clonage de l'amplicon en vecteur T : TA-Cloning Le clonage TA utilise le vecteur p-GEM-T, dont les extrémités en T facilitent la ligature avec l'amplicon PCR généré par la Taq polymérase (figure 1). La ligature a été réalisée avec la T4 DNA ligase pour former un vecteur recombinant prêt à être introduit dans des bactéries compétentes. Figure 1 : Schéma illustrant le clonage TA (TA-Cloning) utilisant le vecteur p-GEM-T. [...]

[...] En effet, depuis 1993, le département Génie Biologique de l'université CY forme des techniciens de laboratoire compétents. Leur équipe pédagogique se compose d'enseignants-chercheurs professionnels. Contexte et objectif La PCR-RFLP est une méthode utilisée en biologie moléculaire pour étudier une diversité génomique dans un échantillon. Son principe repose sur une restriction enzymatique de l'Acide Désoxyribonucléique (ADN) amplifié, par des endonucléases capables de reconnaître des séquences spécifiques Cette approche permet de générer des fragments de tailles différentes pour révéler un polymorphisme Pour étudier cette diversité chez les procaryotes, le gène le plus souvent ciblé est le gène codant pour l'Acide Désoxyribonucléique ribosomique 16S (ADNr 16S) En effet, ce gène est présent universellement chez tous les procaryotes et contient des régions conservées et hypervariables qui permettent de distinguer plusieurs espèces entre elles Dans notre expérience extraits d'ADN plasmidique ont été réalisés simultanément. [...]

[...] Cette enzyme permet la formation d'un vecteur recombinant en reliant le fragment d'ADN au vecteur. Pour cela, un mélange réactionnel a été préparé, comprenant un tampon de ligature à une concentration de 2X, une solution de vecteur plasmidique p-GEMT (50 ng/µL), le produit PCR purifié, et une solution de T4 DNA ligase à 3 U/µL. Les proportions exactes et les volumes ont été ajustés pour obtenir des conditions optimales de ligature. Transformation bactérienne La transformation a été réalisée avec des bactéries Escherichia coli, en mélangeant le produit de ligature avec les cellules, suivie d'une incubation sur glace, d'un choc thermique à 42°C et d'une récupération dans du milieu Luria-Bertani (LB). [...]

[...] La méthode a été réalisée conformément au protocole fourni par le kit du fournisseur Macherey Nagel. Les concentrations en ADN ont été déterminées par un spectrophotomètre Nanovue. Les concentrations et la purification des lysats sont mentionnées dans la figure 3. Digestion par l'enzyme de restriction AluI La restriction enzymatique par l'enzyme AluI permet de distinguer les vecteurs de différentes bactéries ayant des sites de restriction à l'enzyme différents. Pour ce faire, une solution d'ADN plasmidique à 50 ng/?L a été mélangée avec une solution de l'enzyme AluI à 10 de l'eau et du tampon 10X. [...]

[...] La restriction enzymatique a permis d'analyser les profils de restriction des ADN plasmidiques extraits. Un total de cinq profils bactériens distincts a été identifié sur un gel d'électrophorèse, confirmant la diversité des espèces présentes initialement dans l'échantillon. Ainsi, le protocole a permis d'atteindre l'objectif visé. Des perspectives incluent le séquençage des gènes identifiés pour une identification plus précise et une analyse de l'efficacité de la PCR. Ce projet a permis de renforcer les compétences techniques en biologie moléculaire tout en se familiarisant avec la méthode de la PCR-RFLP. [...]