Caractérisation moléculaire des ressources du CIRM - CFBP pour le genre Streptomyces et mise au point de PCR de détection pour le genre Streptomyces et le complexe Pseudomonas syringae

Nicolas D.

Commandez une rédaction : Rapport de stage en Biologie sur mesure

Devis en ligne gratuit

Rapport de stage Format .doc

Caractérisation moléculaire des ressources du CIRM - CFBP pour le genre Streptomyces et mise au point de PCR de détection pour le genre Streptomyces et le complexe Pseudomonas syringae

Télécharger

Lire un extrait

Thèmes abordés

Caractérisation moléculaire des ressources du CIRM - CFBP, genre Streptomyces, complexe Pseudomonas syringae, Institut National de Recherche Agronomique (INRA), Institut de Recherche en Horticulture et Semences (IRHS), PCR de détection, bactéries du genre Streptomyces, mise en suspension d’une souche bactérienne, technique PCR (Polymerase Chain Reaction), PCR 16S, PCR de détection par paire d'amorces, CR de détection par paire d'amorces

Lecture
Résumé
Sommaire
Extraits

Résumé du document

L'Institut National de Recherche Agronomique (INRA) est un organisme menant des recherches finalisées pour une alimentation saine, une agriculture durable et pour un environnement préservé et valorisé.

Pour répondre à ces 2 derniers objectifs, l'Institut de Recherche en Horticulture et Semences (IRHS) propose une approche transdiciplinaire pour étudier les problématiques autour de la qualité et de la santé des produits végétaux, à travers plusieurs thématiques spécifiques. L'une d'elles concerne les travaux de l'équipe EmerSys en ce qui concerne l'amélioration des connaissances par rapport aux bactéries phyto-pathogènes. Pour que cet objectif soit rendu possible, un travail préalable de conservation/préservation, mise à disposition et caractérisation moléculaire des bactéries est réalisé par la Collection Française des Bactéries associées aux Plantes (CFBP). Elle comporte plus de 7 000 souches, réparties sur 65 genres bactériens différents couvrant l'ensemble de la diversité connue des bactéries phyto-pathogènes de plantes.

Sommaire

Introduction
1. Contexte et environnement
2. Présentation du sujet de stage
Matériel et méthodes
1. Les souches étudiées
2. Obtention d'une suspension bactérienne
3. Technique PCR
4. Visualisation par électrophorèse sur gel d'agarose/BET
5. Envoi au séquençage
6. Réception et analyse des séquences
Analyse des résultats
1. Obtention des séquences 16S
2. Mise au point de la PCR de détection genre Streptomyces
3. Mise au point de la PCR de détection phylogroupes Pseudomonas syringae
Discussions
1. Problèmes rencontrés
2. Qualité des résultats
Conclusion
1. Degré de réalisation des objectifs
2. Perspectives

Accédez gratuitement au plan de ce document en vous connectant.

Extraits

[...] Les bactéries se développent sur le milieu dans un délai de 2 à 4 jours selon les genres étudiés. Figure 5 : Illustration de méthode d'ensemencement selon la technique du cadran 4. Repiquage des bactéries L'objectif est d'amplifier le développement bactérien. Pour ce faire, quelques colonies isolées sont prélevées et déposées de nouveau, avec la même méthode d'ensemencement. Les colonies vont se développer pendant environ 48 heures Mise en suspension des souches bactériennes Les colonies sont prélevées depuis le milieu de culture et sont cette fois- ci mélangées à de l'eau stérile de façon à obtenir une suspension trouble. [...]

[...] Les résultats négatifs correspondent aux souches pour lesquelles le test PCR 16S sur suspension fraîche n'a pas pu être effectué, faute de suspension fraîche disponible à l'heure actuelle Nettoyage et obtention des séquences consensus Parmi les 49 souches envoyées à séquencer ont produit des séquences de bonne qualité permettant d'obtenir des séquences consensus. Nous avons récupéré des séquences non exploitables pour une souche. Celle-ci a été remise en culture. Au total produits sur les 54 du lot, soit ont abouti à une séquence interprétable 11. Adéquation des séquences avec les séquences référencées Vérification sur la base de données RDP La base de données RDP fournit des séquences d'ARNr 16S bactériennes contrôlées, alignées et annotées. En l'interrogeant, il est alors possible de déterminer la taxonomie de la bactérie. [...]

[...] Mise au point de la PCR de détection phylogroupes Pseudomonas syringae 25 IV. Discussions Problèmes rencontrés Culture et suspension bactérienne Conservation d'ADN de bonne qualité Qualité des résultats PCR de détection Streptomyces PCR de détection Pseudomonas syringae 28 V. Conclusion Degré de réalisation des objectifs Obtention des séquences 16S confirmant l'appartenance au genre Streptomyces Mise au point d'un outil de détection fiable pour le genre Streptomyces Mise au point d'un outil de détection d'un ou plusieurs phylogroupes pour le complexe Pseudomonas syringae Perspectives Les apports des travaux effectués Pistes de recherche à développer dans les missions futures 31 VI. [...]

[...] Interrogation de la base de données du NCBI Après analyse à partir des séquences sous format FASTA, l'outil nous propose une liste de bactéries, triées par ordre de similarité en tenant compte du pourcentage d'homologie liée à la structure de la séquence (pourcentage d'identité) et liée à la taille de séquence couverte (« Query cover »). Nous retiendrons l'élément dont le genre correspond à un pourcentage d'homologie de 100% pour ces deux critères. Parmi les séquences consensus obtenues répondent aux critères requis. [...]

[...] Programme Les cycles d'amplification sont réalisés sur un thermo-cycleur, selon un programme spécifique aux propriétés d'hybridation des amorces au travers de leur température de fusion (Tm). Programme ion cycles) tion (finalisat ion) Dénaturation Hybridation Elongatio n Programme : ion cycles) tion (finalisat ion) Gène Amorces Séquence Taille Tm attendue Sur la base bibliographique de travaux de détection effectués sur des souches du genre Streptomyces (Saadoun and Gharaibeh, 2007), nous décidons de reprendre les couples d'amorces RI7/RI8, AM45/AM47, qui amplifient des régions conservées du gène 16S et Strb1F/Strb1R, qui s'hybrident sur le gène strb1 codant pour la streptomycine amidinotransférase. [...]

doc