Étude du mécanisme utilisé par une protéine structurale pour courber l'ADN : caractérisation par mutagenèse dirigée

Benoit D.

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Étude du mécanisme utilisé par une protéine structurale pour courber l'ADN : caractérisation par mutagenèse dirigée

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Mémoire de stage effectué au sein du CNRS d'Orléans (biophysique moléculaire) portant sur l'Étude du mécanisme utilisé par une protéine structurale pour courber l'ADN : caractérisation par mutagenèse dirigée.

Sommaire

I) Étude de la protéine MC1
II) Obtention d'une protéine mutante

Matériel et méthodes

I) Obtention de protéines mutantes

A. Mutagénèse
1. Pureté des oligonucléotides
2. PCR
B. Transformation de bactéries et purification de plasmides

C. Production de protéines mutantes
D. Purification de protéines
E. Récapitulatif des activités réalisées

II) Étude de la fixation du "Double Mutant" sur l'ADN

A. Préparation d'ADN radiomarqué de 26pb (spécifique)
B. Préparation d'ADN radiomarqué de 16pb (non spécifique)

III) Résultats et discussion

A. Mutagénèse
B. Séquençage
C. Production de la protéine mutante
D. Purification de la protéine
E. Analyse de l'interaction entre l'ADN et la protéine native/mutante

Conclusion et perspectives

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Extraits

[...] À partir de cette solution nous préparons une solution à 50µg.mL-1 : dilution au 1/1000ème dans de l'eau. [...]

[...] Obtention d'une protéine mutante . Principe . Remarques . Matériel et méthodes . I Obtention de protéines mutantes . Mutagénèse . a. Pureté des oligonucléotides . b. [...]

[...] Ce phénomène s'explique par le fait qu'une deuxième molécule de protéines peut se fixer sur l'ADN (d'où le retard de mobilité engendré). Pour la protéine oxydée le processus est différent puisque la deuxième bande correspond à la fixation de protéines oxydée. En effet, dans C2 Complexes C1 la solution de protéines oxydées il y a deux populations de molécules : des protéines endommagées et des protéines natives qui sont restées intactes. Dès lors il existe dans ce cas deux types de complexes C1 (ceux formés par la protéine native et ceux formés par la protéine oxydée. [...]

[...] A la fin nous récupérons 75µl de solution concentrée (DO gel SDS pour vérifier la pureté de la proteine. finale = soit 7,8µg.µL- La solution est diluée au 1/8ème et plusieurs volumes ainsi qu'un témoin sont chargés sur un Témoin P1 P2 P3 L'observation directe du gel nous montre qu'il n'y a pas présence de bandes parasites dans nos échantillons. De plus la protéine est bien présente dans tous les échantillons ( et 0,1µg). Il y a donc bien présence de MC1 dans notre solution concentrée, la pureté étant estimée à 95%. [...]

[...] MC1 est une protéine de 93 acides aminés (11kDa), essentiellement basique avec une charge nette de +12 à pH neutre (elle comporte 24 acides aminés basiques et 12 acides). Elle est capable de compacter et de fortement courber l'ADN. MC1, contrairement à d'autres protéines de type histone (HU d'E.coli par exemple), possède une très forte affinité pour l'ADN linéaire et une fixation encore supérieure sur les structures circulaires et cruciformes. Structure La structure de MC1 a été déterminée par RMN par Paquet et coll. (2004). [...]

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