Hépatite auto-immune, FACS Fluorescent Activated Cell Sorter, couplage de peptides, souris transgéniques, foie, déplétion lymphocytes B, ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, lymphocytes T, nucléoprotéine, mimétisme moléculaire, immunologie, pathogènes, génétique, anticorps
L'hépatite auto-immune est une maladie d'étiologie inconnue caractérisée par une destruction progressive du parenchyme hépatique médiée par le système immunitaire, suite à un bris de la tolérance immunitaire envers certaines protéines hépatiques. Le laboratoire où j'ai effectué mon stage a développé une souris modèle d'hépatite auto-immune : la souris transgénique TTR-NP. Ces souris expriment la nucléoprotéine (NP) du virus de la choriomeningite lymphocytaire (LCMV), sous contrôle du promoteur de la transthyrétine (TTR), spécifiquement au niveau du foie. Pour briser la tolérance immunitaire envers cette néo-protéine du soi, les souris ont co-injectées par voie intramusculaire avec un plasmide contenant de l'ADN recombinant codant pour la protéine de fusion CTLA-4-NP (plasmide pCMV-CTLA-4-NP) et un deuxième plasmide contenant de l'ADN codant pour l'interleukine 12 (pVR-IL12). Suite à cette injection, ces souris développent des auto-anticorps contre la NP. Cette réponse immunitaire B pas encore connue en détail a été l'objet d'une étude visant à la caractériser.
Pour cela, un groupe de souris TTR-NP ayant subi une déplétion en lymphocytes B et un groupe de souris TTR-NP témoin ont été utilisées. Un dosage quantitatif des auto-anticorps présents dans le sérum de ces deux groupes de souris a été effectué afin d'étudier le rôle des lymphocytes B dans le développement de la maladie.
Une étude qualitative de cette réponse B a également été effectuée, afin de déterminer quels sont les épitopes de la NP ciblés par les auto-anticorps.
Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire B pourrait permettre le développement de nouveaux traitements thérapeutiques pour les patients atteints d'hépatite auto-immune.
[...] Une fragmentation contrôlée du flux liquide conduit à l'emprisonnement de chaque cellule dans une goutte peu après l'analyse. La machine charge alors électrostatiquement chaque goutte contenant une cellule intacte répondant à des critères désignés par le chercheur. Les gouttes chargées sont déviées par un champ électrique constant et dirigées vers des flacons récolteurs. Résultats et discussions ELISA Des tests ELISA ont été effectués afin de doser quantitativement les auto-anticorps présents dans les sérums de souris TTR-NP. Les auto-anticorps détectés à l'aide de cette technique sont des marqueurs du bris de la tolérance immunitaire. [...]
[...] Les haplotypes HLA B8, DR3 et DR4 sont typiquement associés à l'hépatite auto-immune [Béland et al (2009)]. D'autres gènes ont été reliés à l'hépatite auto-immune : les gènes codant pour des protéines ayant une influence sur la réponse immunitaire, innée ou adaptative. Un polymorphisme du gène CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocytes antigen a été retrouvé chez certains patients atteints d'hépatite auto-immune de type 1 [Djilali-Saiah et al (2002)]. Le polymorphisme du récepteur à la vitamine D contribuerait également au développement d'une hépatite auto-immune. [...]
[...] Un anticorps secondaire spécifiquement dirigé contre les immunoglobulines G serait ensuite utilisé. Après révélation et lecture de la plaque, la concentration en immunoglobuline G pourrait être déterminée grâce à une courbe standard d'immunoglobulines G pures. Cette expérience sera également faite sur des sérums de souris déplétées en lymphocytes afin de déterminer si cette déplétion a pour effet secondaire de diminuer le taux d'immunoglobulines G et ainsi de compromettre l'immunité de la souris. Ces tests sont importants, car, ultimement, ce traitement de déplétion des lymphocytes B (anti CD20 humanisé) serait appliqué chez l'humain. [...]
[...] Facteurs environnementaux : il peut s'agir de médicaments, de produits chimiques ou de virus. [Béland et al (2009)]. Quatre modes d'action de ces facteurs sont distingués : L'activation non spécifique des lymphocytes T « au repos » : suite à une exposition à des xénobiotiques tels que des leptines (Concavaline ou des endotoxines bactériennes, les lymphocytes T « au repos » vont être activés. Cette activation se fait de manière non-antigène spécifique et pourrait se produire sur des clones auto-réactifs. [...]
[...] Le plasma est congelé et servira pour le dosage des immunoglobulines totales. Du tampon de lyse (EDTA, bicarbonate de potassium, de chlorure d'ammoniaque) est ajouté sur le culot cellulaire. Sous l'effet de ce tampon, les globules rouges éclatent et les cellules nucléées restent entières. Les échantillons sont alors centrifugés puis rincés au PBS à trois reprises. Le culot cellulaire est ensuite resuspendu dans une solution PBS-5% SVF avec les anticorps. Un anticorps anti-CD16/32 est tout d'abord ajouté, afin d'éviter les interactions non spécifiques. [...]
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